Lateral ultrasensible

May 02, 2023

Nature Biomedical Engineering (2023)Citar este artículo

11k Accesos

1 Citas

115 Altmetric

Detalles de métricas

Los ensayos de flujo lateral (LFA) son rápidos y económicos, pero son casi 1000 veces menos sensibles que las pruebas de laboratorio. Aquí mostramos que los nanorods de oro fluorescentes conjugados con anticuerpos plasmónicamente activos pueden hacer que los LFA convencionales sean ultrasensibles. Con tiempos de muestra a respuesta dentro de los 20 minutos, los LFA mejorados plasmónicamente leídos a través de un escáner de fluorescencia estándar de sobremesa lograron mejoras de aproximadamente 30 veces en el rango dinámico y en los límites de detección en ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas estándar de oro de 4 horas de duración. y logró una sensibilidad clínica del 95 % y una especificidad del 100 % para anticuerpos en plasma y para antígenos en hisopos nasofaríngeos de personas con síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2). También se pueden lograr mejoras comparables en el rendimiento del ensayo a través de un escáner portátil económico, como mostramos para la detección de interleucina-6 en muestras de suero humano y de la proteína de la nucleocápsida del SARS-CoV-2 en muestras nasofaríngeas. Los LFA mejorados plasmónicamente superan las pruebas de laboratorio estándar en sensibilidad, velocidad, rango dinámico, facilidad de uso y costo, y pueden brindar ventajas en el diagnóstico en el punto de atención.

Los ensayos de flujo lateral (LFA) se encuentran entre los métodos de diagnóstico en el punto de atención (POC) más simples, rápidos y económicos, y ofrecen un amplio potencial para la detección de enfermedades a nivel de la población1,2. Aunque se han introducido numerosos LFA para anticuerpos3,4,5 y antígenos6,7 del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2), ninguno tiene una sensibilidad y una cuantificación comparables a los diagnósticos de laboratorio, como la PCR en tiempo real con transcripción inversa. (RT-PCR) y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)8,9,10. En general, los LFA colorimétricos convencionales son ~1000 veces menos sensibles que estas pruebas de laboratorio estándar11,12, y el diagnóstico mediante LFA requiere una prueba adicional de confirmación en el laboratorio para establecer correctamente los resultados negativos. Los LFA colorimétricos suelen ser inadecuados para las lecturas cuantitativas, debido a los cambios de color limitados con respecto a la variación de la concentración del analito objetivo13.

La pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) destacó la necesidad de LFA mejorados para diagnósticos clínicos precisos y rápidos, exámenes de detección masivos y estudios epidemiológicos14,15. La RT-PCR16,17 y las pruebas de antígeno directo18,19 han sido la base para el diagnóstico de COVID-19, y los ensayos serológicos son importantes para determinar el estadio de infección y la eficacia de la vacuna y para los estudios epidemiológicos3,20,21. Estos ensayos de diagnóstico están disponibles solo en laboratorios de microbiología calificados y dependen de expertos, requieren mucho trabajo y tiempo. Estas limitaciones han impedido los millones de pruebas por día que se necesitan durante los picos epidemiológicos22,23. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de herramientas de diagnóstico y detección que no solo sean tan precisas como los ensayos de laboratorio, sino que también sean rápidas, fáciles de usar, económicas, fácilmente disponibles (para uso en el hogar y en el punto de atención) y escalables para una población rápida. cribado a nivel.

Los esfuerzos para mejorar el rendimiento bioanalítico de los LFA han incluido el uso de moléculas fluorescentes o puntos cuánticos como elementos indicadores24,25. Aunque los indicadores fluorescentes mejoran la cuantificación, su intensidad de señal relativamente débil limita su sensibilidad y utilidad de diagnóstico POC, y su baja absorción de luz en comparación con las nanopartículas de oro coloidal convencionales (AuNP)26 impide la detección visual directa que permiten los LFA convencionales. Además, requieren el uso de lectores LFA con detectores de alta sensibilidad o potentes fuentes de luz de excitación. Estas consideraciones limitan la utilidad de los LFA fluorescentes en entornos de cribado masivo y de recursos limitados10.

Visualizamos un LFA 'bimodal' en el que se puede realizar una detección inicial con una prueba visual y se pueden realizar pruebas cuantitativas posteriores cuando sea necesario en la misma tira LFA utilizando un lector de fluorescencia. Para lograr esto, utilizamos una construcción a nanoescala fluorescente ultrabrillante que hemos introducido recientemente27, llamada flúor plasmónico, como un reportero bimodal colorimétrico y fluorescente en LFA (Fig. 1a). Estas construcciones a nanoescala aprovechan la fluorescencia mejorada con plasmones28,29,30,31,32 para lograr una señal de fluorescencia casi 7000 veces más brillante en comparación con los fluoróforos moleculares convencionales. Conjugamos flúor plasmónico con anticuerpos de detección y los usamos para permitir una detección colorimétrica y fluorescente rápida y ultrasensible de analitos, usando interleucina-6 humana (IL-6) (límite de detección (LOD), 93 fg ml−1), SARS-CoV -2 Anticuerpos S1 (subunidad de la proteína espiga) (LOD, 185 pg ml-1) y proteína del antígeno SARS-CoV-2 (nucleocápside (N)) (LOD, 212 pg ml-1). Validamos la eficacia clínica de los LFA basados ​​en flúor plasmónico (p-LFA) analizando muestras de hisopos nasofaríngeos (NP) de plasma, suero y para la detección de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 S1, IL-6 y SARS-CoV- 2, respectivamente, y lograron una alta especificidad y sensibilidad clínica. También demostramos la capacidad cuantitativa de p-LFA utilizando un escáner portátil de diseño propio compatible con fluor plasmónico para demostrar su versátil aplicación POC. Sustancialmente, esta tecnología se puede implementar fácilmente como una alternativa a una prueba de laboratorio para el diagnóstico de infecciones patógenas clínicamente relevantes.

a, Ilustración esquemática del flúor plasmónico, utilizado como nanomarca bimodal (colorimétrica + fluorescente) en LFA, que comprende AuNR como núcleo plasmónico, capa de polímero como espaciador, fluoróforos moleculares (800 CW) y biotina como elemento de reconocimiento. b, c, Imagen de microscopía electrónica de transmisión de AuNP (b) y flúor plasmónico (c). d, valores grises medios obtenidos de la membrana de nitrocelulosa fundida con diferentes concentraciones de AuNP. Recuadro: la imagen procesada ImageJ de 8 bits de la membrana de nitrocelulosa. e,f, Intensidades de fluorescencia obtenidas a partir de membranas de nitrocelulosa moldeadas con diferentes concentraciones de flúor plasmónico (e) y fluoróforo molecular (f). Recuadros: la imagen de fluorescencia correspondiente de la membrana de nitrocelulosa. g, valores grises medios obtenidos de membranas de nitrocelulosa, con BSA biotinilada utilizada como ligando de captura en los sitios de prueba, después de la exposición a diferentes concentraciones de AuNP conjugados con estreptavidina. Recuadro: ilustración esquemática de AuNP conjugados con estreptavidina. h, intensidades de fluorescencia obtenidas a partir de membranas de nitrocelulosa, con BSA biotinilada como elementos de reconocimiento en los sitios de prueba, después de la exposición a diferentes concentraciones de flúor plasmónico conjugado con estreptavidina. Recuadro: ilustración esquemática de flúores plasmónicos conjugados con estreptavidina. Las flechas moradas indican la dirección del flujo de los nanoconjugados. Los datos son media ± sd; n = 4 pruebas repetidas. Los esquemas se crearon con BioRender.com.

Los flúores plasmónicos se aplicaron por primera vez para superar tres limitaciones fundamentales de los AuNP de 30 a 40 nm utilizados como etiquetas colorimétricas convencionales en LFA. Las AuNP tienen una tasa de captura baja (<5 %), una relación señal/fondo baja y, por lo tanto, una sensibilidad relativamente baja33,34. Incluso con el uso de AuNP de 100 nm, que recientemente demostró mejorar la sensibilidad de LFA35, estos problemas persisten. Debido a estas tres limitaciones, los cambios de color en los LFA basados ​​en AuNP se limitan al análisis cualitativo o simplemente a una salida binaria, lo que indica la presencia o ausencia del analito objetivo.

Para evaluar si los flúores plasmónicos (longitud 98 ± 8,7 nm, diámetro 29,2 ± 3,1 nm) podían superar estas limitaciones, comparamos su rendimiento con AuNP (diámetro 104 ± 13,4 nm) en una membrana de nitrocelulosa. La longitud de onda de resonancia del plasmón de superficie localizada de los flúor plasmónicos (y el núcleo de la nanovarilla de oro (AuNR)) se ajustó para que coincidiera con las longitudes de onda de excitación y emisión de los fluoróforos moleculares27 mediante la modificación de sus relaciones de aspecto36,37, y se eligieron las dimensiones óptimas de las nanoestructuras para maximizar la mejora de la fluorescencia, sobre la base de nuestro estudio anterior38. Nos propusimos determinar el número mínimo de AuNP y flúor plasmónico necesarios para producir una señal visible o de fluorescencia detectable. Cuando las AuNP diluidas en serie (Fig. 1b y la Fig. 1 complementaria) y los flúor plasmónicos (Fig. 1c y la Fig. 1 complementaria) de concentración conocida se arrojaron sobre una membrana de nitrocelulosa, se necesitaron acumulaciones de ~ 106 AuNP y flúor plasmónico para producir una señal visible discernible (Fig. 1d y Fig. 2 complementaria). Sin embargo, solo se requirieron ~ 102 flúores plasmónicos para producir una señal de fluorescencia detectable (Fig. 1e y Fig. 3 complementaria). Además, se requirieron acumulaciones de ~ 0.6 × 106 fluoróforos moleculares (800 CW, la unidad de fluorescencia de los fluor plasmónicos) para producir una señal de fluorescencia detectable (Fig. 1f), lo que indica un umbral de concentración ~ 6,000 veces más bajo para una señal de fluorescencia detectable con plasmónico flúor en comparación con los fluoróforos moleculares.

Los flúores plasmónicos exhibieron una señal colorimétrica casi idéntica a la de los AuNP (Fig. 4 complementaria). La señal colorimétrica permitió la detección visual cualitativa (a simple vista), eliminando la necesidad de un equipo de lectura especializado en una concentración relativamente alta del analito objetivo, mientras que la señal de fluorescencia permitió la detección ultrasensible y la cuantificación de analitos de baja abundancia. Por lo tanto, los flúor plasmónicos funcionan como nanomarcas bimodales (colorimétricas + fluorescentes) y ofrecen una detección ultrasensible en un ensayo biológico representativo de LFA.

A continuación, para comparar el rendimiento de los fluoruros plasmónicos y las AuNP en formato LFA, utilizamos el emparejamiento conjugado biotina-estreptavidina bien caracterizado, conocido por exhibir una afinidad de unión extremadamente alta39. Tanto las AuNP como los flúores plasmónicos se funcionalizaron con estreptavidina y se utilizó albúmina de suero bovino (BSA) biotinilada como ligando de captura. Luego, las tiras de LFA se sometieron a diferentes concentraciones conocidas de AuNP conjugados con estreptavidina y flúor plasmónico durante 20 minutos (Fig. 5 complementaria). Las nanomarcas fluyen a lo largo de la membrana de nitrocelulosa por fuerza capilar y son capturadas por el ligando de captura, lo que lleva a la acumulación de nanopartículas en el punto de prueba. La acumulación de una cantidad suficiente de nanoetiquetas convierte el color en el sitio de prueba en rojo, lo que indica un resultado positivo y la presencia del analito objetivo. La intensidad promedio en escala de grises de la señal colorimétrica en el sitio de prueba con AuNP y la señal de fluorescencia con flúor plasmónico aumentó monótonamente con la concentración de las nanoetiquetas (Fig. 1g, h). En particular, tanto para AuNP como para flúor plasmónico, se necesitan ~ 107 nanopartículas para producir una señal visible discernible; sin embargo, solo ~103 flúor plasmónico son suficientes para producir una señal de fluorescencia detectable. El umbral de concentración más bajo de cuatro órdenes de magnitud para una señal detectable con flúor plasmónico en comparación con AuNP en el formato LFA es consistente con el enfoque de fundición por caída discutido anteriormente. Estos resultados establecen la base fundamental de que los flúor plasmónicos pueden servir como nanomarcadores ultrabrillantes para la detección ultrasensible de analitos objetivo en un LFA.

Optimizamos el rendimiento bioanalítico de LFA ajustando la concentración del ligando de captura y las nanoetiquetas. Utilizamos biotina-estreptavidina como sistema modelo. Tanto los AuNP como los flúores plasmónicos se funcionalizaron con biotina; Se utilizaron estreptavidina y BSA biotinilada como analito objetivo y ligando de captura, respectivamente (Fig. 6 complementaria). Se observó que a medida que aumentaba la concentración del ligando de captura (es decir, BSA biotinilado), tanto la intensidad media de escala de grises como la intensidad de fluorescencia del punto de prueba correspondiente a AuNP (Fig. 7 complementaria) y flúor plasmónico (Fig. 8 complementaria), respectivamente, aumentó. Estos resultados sugieren que concentraciones más altas del ligando de captura dan como resultado una mejor intensidad de señal. Además, a medida que aumentaba el número de nanoetiquetas, tanto la intensidad media de escala de grises como la intensidad de fluorescencia del punto de prueba correspondiente a AuNP (Fig. 9 complementaria) y flúores plasmónicos (Fig. 10 complementaria), respectivamente, aumentaron, lo que implica una mejor intensidad de señal con un mayor número de nanoetiquetas. Sin embargo, en ambos casos, la señal de fondo (señal de la tira LFA fuera del punto de captura) también aumentó con el número de nanomarcas. Por lo tanto, el número óptimo de nanomarcas para LFA basado en AuNP y p-LFA se determinó restando la señal de fondo de la señal del punto de prueba. Como era de esperar, el número óptimo de flúor plasmónico (1,2 × 106) fue cuatro órdenes de magnitud inferior al número óptimo de AuNP (1,78 × 1010).

A continuación, comparamos los parámetros bioanalíticos (LOD, límite de cuantificación (LOQ) y rango dinámico) de LFA y p-LFA basados ​​en AuNP de biotina-estreptavidina. Vale la pena señalar que la señal colorimétrica, obtenida de las imágenes procesadas por ImageJ de 8 bits de las tiras LFA, tanto de AuNP como de flúor plasmónico, exhibe un LOD similar, lo que sugiere que no hay pérdida en las capacidades de detección visual en p-LFA (Suplementario Fig. 11). El LOD (definido como la media + 3σ del blanco; σ es la desviación estándar) del LFA colorimétrico se calculó en 4,8 ng ml−1 (Fig. 12 complementaria, logística de cinco parámetros). Por el contrario, el p-LFA fluorométrico permitió la detección hasta 2,3 pg ml−1 (Fig. 13 complementaria, ajuste logístico de cinco parámetros), lo que representa una mejora de ~2000 veces en el LOD. El LOQ (definido como la media + 10σ del blanco) del p-LFA fluorométrico es ~2500 veces mejor que el LOQ del LFA colorimétrico. Además, el componente fluorescente del flúor plasmónico aumentó el rango dinámico del ensayo en tres órdenes de magnitud. Por lo tanto, debido a la señal de fluorescencia ultrabrillante de los flúor plasmónicos, los p-LFA permiten la detección ultrasensible del analito objetivo en un rango mucho más amplio de concentración de analito.

Las citoquinas son proteínas pequeñas (5–26 kDa) involucradas en la señalización celular y la inmunomodulación y son indicadores críticos de salud y enfermedad40. Se sabe que varias enfermedades, como el cáncer, la sepsis, el virus de la inmunodeficiencia humana, la inflamación crónica y las enfermedades autoinmunes, están asociadas con la desregulación del sistema inmunitario, lo que lleva a la interrupción del sutil equilibrio entre las citoquinas proinflamatorias y antiinflamatorias41,42. Las citoquinas proinflamatorias incluyen IL-1, IL-6, IL-12, factor de necrosis tumoral-α e interferón-γ, mientras que las citoquinas antiinflamatorias incluyen factor de crecimiento transformante-β, IL-10 e IL-4. La monitorización rápida del estado inmunitario mediante el análisis de las citoquinas séricas y el diagnóstico precoz de estas enfermedades es esencial para una intervención clínica rápida y para inhibir la progresión de la enfermedad. Aunque recientemente se han introducido pocos LFA para la detección de IL-643,44, ninguno proporciona una sensibilidad y una cuantificación comparables al ELISA estándar de oro. Por lo tanto, usamos IL-6 como analito objetivo modelo para investigar la aplicabilidad de nuestro p-LFA.

Los anticuerpos de captura de IL-6 humana y los anticuerpos antiinmunoglobulina G (IgG) de oveja se inmovilizaron en una membrana de nitrocelulosa para formar puntos de prueba y control, respectivamente (Fig. 2a y Fig. 14 complementaria). El LOD de LFA colorimétrico basado en AuNP (Fig. 2b) y de LFA basado en fluoróforo molecular se calculó en 166 pg ml-1 (Fig. 2c, ajuste logístico de cinco parámetros) y 362 pg ml-1 (Fig. 15), respectivamente. Por el contrario, el p-LFA fluorométrico (Fig. 2d) permitió la detección hasta 93 fg ml−1 (Fig. 2e, ajuste logístico de cinco parámetros), lo que representa una mejora de 1785 veces en el LOD en comparación con AuNP- convencional. basados ​​en LFA y al menos un orden de magnitud mayor que los LFA informados anteriormente43,44,45,46. El LOQ de p-LFA fluorométrico (298 fg ml-1) es 2288 veces mejor que el LOQ de LFA colorimétrico (682 pg ml-1). Además, el flúor plasmónico mejoró el rango dinámico del LFA en casi tres órdenes de magnitud. La señal colorimétrica de AuNP y p-LFA exhibió LOD similares, lo que sugiere que no hay pérdida en las capacidades de detección visual en p-LFA (Fig. 2f, g y Fig. 16 complementaria). Además, la señal de fluorescencia de los flúor plasmónicos permitió la detección ultrasensible y el análisis cuantitativo en un rango mucho más amplio de concentración de analito (Fig. 2e, h).

a, Ilustración esquemática de tiras LFA de IL-6 que comprenden un punto de prueba de anticuerpos de captura de IL-6 y un punto de control de IgG de oveja. b, c, Ilustración esquemática de LFA de IL-6 basado en AuNP (b) y valores grises medios dependientes de la dosis (c), correspondientes a diferentes concentraciones de IL-6, adquiridas de estos LFA basados ​​en AuNP. d,e Ilustración esquemática de IL-6 p-LFA (d) e intensidades de fluorescencia dependientes de la dosis de IL-6 p-LFA (e). f, g, Imágenes procesadas por ImageJ de ocho bits de IL-6 LFA (f) e IL-6 p-LFA (g) basados ​​en AuNP, que representan el modo de lectura visual. h, Imágenes de fluorescencia de las tiras de IL-6 p-LFA que representan el modo de lectura de fluorescencia. i, curvas RMC para ELISA, p-FLISA y p-LFA (consulte la Información complementaria para los cálculos). Las líneas discontinuas indican los puntos de corte de RMC en µ = 2 y µ = 5; las intersecciones de líneas discontinuas y curvas RMC indican el rango de concentraciones en el que se logra un rendimiento cuantitativo específico del ensayo. Para IL-6 p-LFA, µ < 2 en un rango de concentración de 0,13–86,0 pg ml−1, lo que sugiere que IL-6 p-LFA puede distinguir señales correspondientes a dos concentraciones dentro de ese rango que difieren en al menos un 100 % con al menos un 99% de confianza. Los parámetros RMC relevantes se enumeran en la Tabla complementaria 1. j, Estabilidad de IL-6 p-LFA durante 7 meses, como lo demuestra el error en las estimaciones de concentración de IL-6 deducidas utilizando cuatro curvas estándar diferentes obtenidas en un lapso de 7 meses. Los esquemas se crearon con BioRender.com.

También comparamos la sensibilidad y el LOD de p-LFA fluorométrico con ELISA estándar de oro y ensayo inmunoabsorbente ligado a flúor plasmónico (p-FLISA) implementado en una placa de microtitulación (Fig. 17 complementaria). El LOD de p-LFA es casi 30 veces menor en comparación con el ELISA sándwich convencional (2,9 pg ml-1) y solo 5 veces inferior al de p-FLISA (16,8 fg ml-1) (Fig. 18 complementaria). Sin embargo, el tiempo de muestra a respuesta para p-LFA fue de 20 min, mientras que ELISA y p-FLISA requieren 4 h.

Para evaluar la capacidad del p-LFA fluorométrico para resolver con precisión los cambios en la concentración de IL-6 humana, cuantificamos la resolución de la concentración molecular (RMC), una métrica introducida recientemente que indica si los cambios en la concentración del analito se pueden discriminar con significancia estadística47. Esta métrica es complementaria al LOD: mientras que el LOD bajo representa la concentración de analito más pequeña que se puede distinguir del fondo, RMC representa el cambio de concentración más pequeño que se puede discriminar con un 99 % de certeza47. Comparamos el RMC de ELISA, p-FLISA y p-LFA para la resolución de cambios dobles en la concentración de IL-6 humana (parámetro RMC µ = 2, lo que significa que podría resolverse un cambio doble en la concentración). Las curvas de RMC para p-LFA exhibieron µ ≤ 2 en un rango de concentración de 0.13–86.1 pg ml−1, dos órdenes de magnitud más bajas que las de ELISA (Fig. 2i) y casi idénticas a las de p-FLISA. Esto sugiere que IL-6 p-LFA puede distinguir señales correspondientes a dos concentraciones que difieren en al menos un 100 % dentro de ese rango con al menos un 99 % de confianza. La función RMC y otros parámetros bioanalíticos de p-FLISA y p-LFA, enumerados en la Tabla complementaria 1, indican que el rendimiento del p-LFA compatible con POC de 20 min es casi idéntico al p-FLISA de laboratorio de 4 h.

A continuación, para establecer la estabilidad del p-LFA fluorométrico para la detección cuantitativa sin el uso de estándares, se adquirieron múltiples curvas estándar de IL-6 durante un lapso de 7 meses (Fig. 19 complementaria). Todas las curvas estándar alcanzaron RMC similares (Fig. 20 complementaria) y parámetros bioanalíticos, lo que sugiere una excelente repetibilidad y reproducibilidad. Usando estas curvas estándar, las concentraciones de IL-6 que oscilan entre 1 pg ml-1 y 50 pg ml-1 se cuantificaron con menos del 20% de desviación (Fig. 2j y Fig. 21 complementaria).

En general, el ensayo POC mostró un rendimiento comparable al del ensayo de laboratorio y mostró la capacidad de cuantificar con precisión la concentración del analito sin estándares. Esto no se ha informado anteriormente con la tecnología LFA y determina que los p-LFA superan las limitaciones de larga data de los LFA: sensibilidad limitada, baja precisión y rango analítico más pequeño en comparación con las pruebas de laboratorio y capacidad de cuantificación limitada.

Para evaluar el potencial de traducción clínica de nuestro p-LFA, luego lo optimizamos para la detección de anticuerpos contra el SARS-CoV-2. Persiste una necesidad apremiante de ensayos serológicos sensibles, rápidos y POC para el SARS-CoV-2, tanto para estudios epidemiológicos como para estudios sobre la eficacia de la vacuna contra el SARS-CoV-23,20. Varios LFA3,4,48 y otros métodos de ensayo49 utilizan la proteína de pico del SARS-CoV-2 como elemento de reconocimiento para la detección de anticuerpos contra el SARS-CoV-2. Con p-LFA, nuestro objetivo era extender la sensibilidad y el LOD más allá del rango posible con los ensayos actuales y dentro del rango de ELISA.

La subunidad recombinante SARS-CoV-2 S1 de la proteína de pico se inmovilizó en el punto de prueba y se usó IgG de oveja para el punto de control (Fig. 3a y Fig. 22 complementaria). Primero determinamos los parámetros bioanalíticos de LFA basado en AuNP (Fig. 3b) y p-LFA (Fig. 3d) para la detección del anticuerpo SARS-CoV-2 S1. Usando la señal colorimétrica obtenida de las tiras de LFA, se determinó que el LOD de LFA basado en AuNP era ~ 1.05 µg ml-1 (Fig. 3c). Por el contrario, el p-LFA fluorométrico exhibió un LOD de 185 pg ml−1 (Fig. 3e, ajuste logístico de cinco parámetros), lo que representa una mejora de casi 5675 veces. Además, como se esperaba, las intensidades medias en escala de grises obtenidas tanto de AuNP como de p-LFA exhibieron una sensibilidad similar, lo que sugiere que no se comprometen las capacidades de detección visual (Fig. 3f, g y Fig. 23 complementaria). Sin embargo, la señal de fluorescencia de los flúor plasmónicos permitió la detección ultrasensible y el análisis cuantitativo en un rango mucho más amplio (cuatro órdenes de magnitud más alto) de concentración de analito (Fig. 3e, h). El p-LFA fluorométrico mostró una mejora de 165 veces en el LOD en comparación con el ELISA tipo sándwich convencional (Fig. 3i) y un LOD comparable al de p-FLISA (Fig. 3j).

a, Ilustración esquemática de las tiras de LFA del anticuerpo SARS-CoV-2 S1 que comprenden la proteína recombinante SARS-CoV-2 S1 como elemento de captura en el punto de prueba e IgG de oveja en el punto de control. b, d, ilustraciones esquemáticas del LFA del anticuerpo SARS-CoV-2 S1 basado en AuNP (b) y el LFA del anticuerpo plasmónico-fluor SARS-CoV-2 S1 (d). c, Valores grises medios dependientes de la dosis, correspondientes a diferentes concentraciones de anticuerpo SARS-CoV-2 S1, adquiridos de LFA basado en AuNP. e, relación SNR dependiente de la dosis del anticuerpo p-LFA del SARS-CoV-2 S1 realizado en 20 min. f, g, imágenes procesadas por ImageJ de ocho bits del anticuerpo LFA (f) S1 del SARS-CoV-2 basado en AuNP y el p-LFA del anticuerpo S1 del SARS-CoV-2 (g), que representan el modo de lectura visual. h, imágenes de fluorescencia de tiras de p-LFA del anticuerpo SARS-CoV-2 S1, que representan el modo de lectura de fluorescencia. i,j Densidades ópticas e intensidades de fluorescencia dependientes de la dosis, correspondientes a diferentes concentraciones de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 S1, obtenidas por ELISA estándar (i) y p-FLISA (j) implementadas en una placa de microtitulación, realizadas en 4 h. Los esquemas se crearon con BioRender.com.

Para evaluar el potencial traslacional de los p-LFA fluorométricos, analizamos 79 muestras de plasma obtenidas de personas positivas para COVID-19 y 48 muestras de suero o plasma no identificadas archivadas que se recolectaron antes de COVID-19 (marzo a octubre de 2019)50 para la presencia de anticuerpos SARS-CoV-2 S1. Las 127 muestras de plasma se diluyeron 500 veces y se analizaron utilizando p-LFA fluorométrico. De las 79 muestras positivas para IgG (positivas por ELISA), 76 dieron positivo (relación señal/ruido (SNR) de la muestra ≥ SNR en blanco + 3σ de blanco) con p-LFA, lo que indica una sensibilidad del 96,2 %. Todas las muestras anteriores a la COVID-19 dieron negativo con LFA para SARS-CoV-2 S1 IgG, lo que indica una especificidad del 100 % (Tabla complementaria 2). Por lo tanto, los p-LFA para la detección de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 ofrecen una aplicabilidad POC con una precisión comparable a la ELISA estándar de oro y con una posible aplicabilidad para la eficacia de la vacuna y los estudios epidemiológicos.

A continuación, evaluamos el potencial de los p-LFA para satisfacer la necesidad crítica de una prueba de antígeno POC SARS-CoV-2 altamente sensible y específica. En las pruebas serológicas de inmunoglobulinas específicas de virus, las respuestas de anticuerpos a los antígenos virales por lo general se detectan en la última etapa de la infección (7 a 14 días después de la exposición al virus); por lo tanto, las pruebas serológicas de anticuerpos no pueden lograr una detección precisa de poblaciones asintomáticas o etapas tempranas de infección51. Además, RT-PCR, el estándar de oro actual en el diagnóstico de COVID-19, ha demostrado ser muy exitoso en la identificación de personas que han contraído el virus SARS-CoV-2; sin embargo, es posible que no distingan entre pacientes infecciosos y no infecciosos y que arrojen resultados falsos positivos durante meses, incluso después de que el paciente se haya recuperado de la enfermedad52,53.

Como los antígenos se expresan solo cuando el virus se está replicando activamente, las pruebas basadas en antígenos pueden tener una mejor correlación con la infecciosidad que la detección de ARN por RT-PCR. Las pruebas actuales de detección de antígenos para diagnosticar la COVID-19 son escalables y convenientes, pero están limitadas por su baja y amplia precisión54,55,56,57. Los LFA para la detección de antígenos del SARS-CoV-2 pueden ser la herramienta más importante para abordar los brotes de infección debido a su facilidad de uso, menor costo y mejor correlación con la infectividad. Actualmente, se han informado varios ensayos de antígenos basados ​​en LFA6,7,58 y se utilizan ampliamente, pero ninguno ofrece la sensibilidad óptima59; por lo tanto, un resultado negativo con dichos análisis en un paciente sintomático requiere una prueba de RT-PCR confirmatoria o una repetición frecuente de la prueba. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de un ensayo de antígeno POC más sensible que sea tan confiable y preciso como el método RT-PCR.

p-LFA proporcionó la precisión y sensibilidad necesarias para esto en muestras de pacientes a los que se les realizaron simultáneamente pruebas de PCR. Nuestra prueba se centró en la detección de la proteína N del SARS-CoV-2. Los puntos de prueba y de control en las tiras de LFA se prepararon inmovilizando anticuerpos de captura de proteína N e IgG de oveja, respectivamente (Fig. 4a y Fig. 24 complementaria). Tanto las señales colorimétricas como las de fluorescencia obtenidas de p-LFA aumentaron monótonamente con un aumento en la concentración del estándar de proteína N (Fig. 4b, c). Sin embargo, se calculó que el LOD y el LOQ del p-LFA fluorométrico eran casi 400 veces mejores que la contraparte colorimétrica, lo que determina la importancia de los flúor plasmónicos como nanomarcas fluorescentes ultrabrillantes (Fig. 4d). Además, el p-LFA fluorométrico mostró una mejora de 37 veces en el LOD en comparación con el ELISA tipo sándwich convencional y un LOD comparable al de p-FLISA (Fig. 4e y Fig. 25 complementaria).

a, Ilustración esquemática de las tiras de p-LFA de proteína N que comprenden anticuerpo de captura de proteína N como punto de prueba e IgG de oveja como punto de control. b,c, Modos de lectura colorimétrica (b) y fluorométrica (c) de p-LFA para la detección de proteína N. d, valores grises medios dependientes de la dosis, correspondientes a diferentes concentraciones de proteína N, adquiridas de p-LFA colorimétrica (negro) y SNR dependiente de la dosis de p-LFA fluorométrica de proteína N realizada en 20 min (rojo). e, Densidades ópticas e intensidades de fluorescencia dependientes de la dosis, correspondientes a diferentes concentraciones de proteína N, obtenidas por ELISA estándar (negro) y p-FLISA (rojo) implementado en una placa de microtitulación, realizado en 4 h. f, Comparación de p-LFA fluorométrico (rojo) y kit de antígeno rápido POC comercial (BD Veritor) (negro). g, SNR de proteína N en muestras de hisopos NP con PCR positiva (SARS-CoV-2 de tipo salvaje) determinado por p-LFA colorimétrico (gris), p-LFA fluorométrico (negro) y BD Veritor. h, Comparación de p-LFA colorimétrico (gris) y fluorométrico (negro) en términos de su capacidad para cuantificar las concentraciones de proteína N presentes en muestras de hisopos NP de 35 muestras PCR positivas (19 SARS-CoV-2 de tipo salvaje y 16 Delta variante). ND, no detectado. i, SNR de proteína N en muestras de hisopos NP dio negativo para COVID-19 y positivo para diferentes coronavirus estacionales y otros virus respiratorios. Los esquemas se crearon con BioRender.com.

A continuación, para demostrar la ventaja de los p-LFA sobre un método de prueba de antígeno POC rápido aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) comercial existente de la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. muestras con concentraciones por debajo de 50 ng ml−1 como 'presuntamente negativas' (Fig. 4f). Esto implica que el p-LFA fluorométrico ofrece una sensibilidad analítica casi 235 veces mejor en comparación con la prueba de antígeno comercial. El p-LFA superó al kit de antígenos BD Veritor aprobado por la FDA al analizar muestras de pacientes con COVID-19 con PCR positivo (SARS-CoV-2 de tipo salvaje). El kit de antígeno BD Veritor y el p-LFA colorimétrico identificaron correctamente 8 de las 19 muestras de hisopos NP positivas para PCR (sensibilidad analítica, 42,1 %), mientras que el p-LFA fluorométrico identificó correctamente 18 de las 19 muestras (sensibilidad analítica, 94,7 %) (Fig. .4g). Trece de las catorce muestras de pacientes en la etapa inicial de la enfermedad (<10 días desde el inicio de los síntomas) dieron positivo mediante p-LFA fluorométrico (93 % de sensibilidad), mientras que solo siete dieron positivo con BD Veritor (50 % de sensibilidad) (Tabla complementaria 3). En particular, el kit de antígeno BD Veritor aprobado por la FDA solo se puede usar en formato negativo/positivo; sin embargo, el p-LFA fluorométrico permitió la detección cuantitativa del analito objetivo en muestras de pacientes (Tabla complementaria 4). También comparamos el rendimiento cuantitativo de p-LFA colorimétrico y fluorométrico. Si bien solo 3 de 19 muestras fueron cuantificables (por encima del LOQ) a través de p-LFA colorimétrico, 18 de 19 muestras fueron cuantificables a través de p-LFA fluorométrico (Fig. 4h).

Para corroborar aún más el potencial de traducción clínica de los p-LFA fluorométricos para la detección de proteína N, analizamos 16 muestras de pacientes con hisopo NP de la variante Delta B.1.617.2 PCR positiva (confirmada por secuenciación de genes). El p-LFA colorimétrico detectó la proteína N en 7 de las 16 muestras positivas de la variante Delta, de las cuales solo 3 fueron cuantificables. Sin embargo, el p-LFA fluorométrico detectó proteína N en las 16 muestras, de las cuales 15 eran cuantificables (por encima del LOQ) (Fig. 4h, Fig. 26 complementaria y Tabla 5 complementaria). También analizamos 17 muestras de Omicron BA.1 positivas para PCR (confirmado por secuenciación de genes) y observamos que p-LFA fluorométrico arrojó resultados positivos para 16 de 17 muestras de variantes de Omicron (Figura 27 complementaria y Tabla complementaria 6). Todas las muestras de pacientes con Omicron positivo se recogieron en un período breve desde el inicio de los síntomas (1 a 2 días) y todos menos uno tenían una enfermedad muy leve (Tabla complementaria 7). Estos hallazgos establecen la eficacia de p-LFA para la detección temprana de proteína N.

Se analizó un total de 52 muestras PCR positivas. Mientras que solo 15 de 52 arrojaron resultados positivos con p-LFA colorimétrico, lo que indica una sensibilidad clínica del 28,8 %, 50 de 52 dieron positivo con p-LFA fluorométrico (SNR > media + 3σ), lo que indica una sensibilidad analítica del 96,2 %. La sensibilidad diagnóstica de p-LFA para muestras con carga viral baja (valores de umbral de ciclo (CT) ≥25) fue del 91,7 % (11 de 12), y para muestras con carga viral alta (valores de CT <25) fue del 97,5 % ( 39 de 40). Esta sensibilidad diagnóstica fue sustancialmente más alta que las reportadas previamente para las pruebas rápidas de antígeno/POC SARS-CoV-2 (~80 % para muestras con valores de CT <25 y 20–40 % para muestras con valores de CT ≥25)7,59,60 ,61.

Finalmente, para evaluar la especificidad de p-LFA a la proteína N del SARS-CoV-2, analizamos 19 muestras de hisopos NP con PCR negativas. Las muestras de hisopos NP negativas comprendían una combinación de muestras sanas y muestras que dieron positivo para coronavirus estacionales y otros virus respiratorios. Todas las 19 muestras PCR negativas dieron negativo (SNR

Finalmente, para determinar la aplicabilidad de esta tecnología de biodiagnóstico en entornos de POC, validamos el rendimiento de p-LFA utilizando un escáner de fluorescencia portátil y económico. Tenga en cuenta que el desplazamiento de Stokes correspondiente a los flúor plasmónicos es mucho más pequeño (~15 nm) que el correspondiente a las nanopartículas fluorescentes de uso común, como los puntos cuánticos y las nanopartículas de europio (cientos de nanómetros)62,63. Hasta donde sabemos, no hay disponible comercialmente ningún escáner de fluorescencia portátil y económico compatible con el flúor plasmónico. Por lo tanto, desarrollamos un escáner de fluorescencia portátil de bajo costo para leer p-LFA usando flúores plasmónicos como nanoetiquetas. El prototipo del escáner, con dimensiones de 25 × 25 × 19 cm (L × B × H), se construyó utilizando componentes ópticos listos para usar disponibles de forma rutinaria (consulte Métodos para obtener una descripción detallada; Fig. 5a y Fig. 28 complementaria) . El costo total del escáner es de US$1.429 y el componente más caro es el láser, que cuesta US$919. Cabe señalar que para todas las medidas descritas en este trabajo, la potencia del láser (fuente de excitación) se fijó al 1% de la potencia máxima para evitar la saturación de la señal de fluorescencia. Por lo tanto, estos componentes pueden miniaturizarse y reemplazarse con componentes menos costosos para su comercialización. Además, el escáner portátil puede funcionar con una batería y, por lo tanto, puede implementarse inmediatamente en entornos con recursos limitados.

a, Fotografía del escáner de fluorescencia portátil. b, Ilustración esquemática del casete LFA utilizado en el estudio y el flujo de trabajo de p-LFA. S, T y C corresponden a la almohadilla de muestra, la línea de prueba y la línea de control, respectivamente. La flecha azul representa la dirección de las mediciones de fluorescencia realizadas en el casete LFA con el escáner portátil. c, Señales representativas positivas (negras) y negativas (rojas) obtenidas con el escáner portátil. d, Intensidades de fluorescencia (esferas negras) y valores del área bajo la curva (esferas rojas) obtenidos de tiras LFA, moldeadas con diferentes concentraciones de flúor plasmónico, escaneadas con escáneres portátiles y de sobremesa. e, Imagen procesada ImageJ de ocho bits del p-LFA colorimétrico IL-6 de tira completa que representa el modo de lectura visual. f, Imagen de fluorescencia del p-LFA fluorométrico de IL-6 de tira completa que representa el modo de lectura de fluorescencia. g, Señal dependiente de la dosis de p-LFA fluorométrica de IL-6 de 15 min medida con escáneres de sobremesa (negro) y portátiles (rojo). h, gráfico de regresión lineal de la concentración de IL-6 en muestras de suero determinado por p-LFA fluorométrico y medido con escáneres portátiles y de sobremesa. i, Gráfica de regresión lineal de la concentración de IL-6 en muestras de suero determinada por p-FLISA de laboratorio de 4 h y un escáner de fluorescencia de mesa, en comparación con las mediciones realizadas usando p-LFA fluorométrico de 15 min y el escáner portátil. j, Gráfica de regresión lineal de la concentración de proteína N en muestras de hisopos NP determinado por p-LFA fluorométrico y medido usando los escáneres de sobremesa y portátiles. Los datos son media ± sd; n = 2 × 2 pruebas repetidas. El esquema fue creado con BioRender.com.

Fabricamos LFA de tira completa con muestras separadas y almohadillas de conjugado junto con membranas de prueba y almohadillas absorbentes. La tira ensamblada se incrustó en un casete LFA estándar (Fig. 5b y Fig. 29 complementaria). Las mediciones de fluorescencia se realizaron trasladando el casete utilizando un actuador de desplazamiento a lo largo del sistema óptico del escáner portátil en la dirección de la flecha azul en la Fig. 5b. Esto produjo un rastro del valor de píxel (intensidad de la señal), promediado a partir de diez imágenes, frente a la longitud de recorrido de la membrana de prueba, tomada en incrementos de 100 µm (Fig. 5c). En consecuencia, un resultado positivo válido tiene picos en las líneas de prueba y de control, y un resultado negativo tiene un pico solo en la línea de control. Una prueba sin un pico en la línea de control se considera un resultado no válido (Fig. 30 complementaria).

En primer lugar, para comparar el rendimiento del escáner portátil con el escáner de sobremesa, determinamos la cantidad mínima de nanoetiquetas que cada escáner podría detectar. Cuando los flúores plasmónicos diluidos en serie (Fig. 5d y Fig. 31 complementaria) y fluoróforos moleculares de 800 CW (Figs. 32 y 33 complementarias) de concentración conocida se arrojaron sobre las membranas de prueba, se necesitaron acumulaciones de ~ 100 flúor plasmónicos para producir intensidad de fluorescencia detectable (media del blanco + 3σ) cuando se midió con el escáner de sobremesa, y se necesitaron ~ 200 flúores plasmónicos para el escáner portátil (Fig. 5d). Se necesitaron acumulaciones de ~0,6 × 106 fluoróforos moleculares (no mejorados plasmónicamente) para producir una intensidad de fluorescencia detectable cuando se midió con el escáner de sobremesa o portátil. Los datos adquiridos por el escáner portátil y la metodología de procesamiento de datos posterior se analizan en detalle en Información complementaria (Figuras complementarias 34 y 35). Estas observaciones indican un rendimiento casi idéntico de los escáneres portátiles y de sobremesa en la detección de la señal de fluorescencia de los flúores plasmónicos.

A continuación, para demostrar el flujo de trabajo compatible con POC de p-LFA y comparar el rendimiento de los escáneres portátiles y de sobremesa, utilizamos IL-6 humana como analito modelo. Los anticuerpos de captura de IL-6 humana y los anticuerpos anti-IgG de oveja se imprimieron en una membrana de nitrocelulosa para formar líneas de prueba y control, respectivamente (Fig. 36 complementaria). El LOD del IL-6 p-LFA colorimétrico en formato de tira completa (Fig. 5e) se calculó en ~ 526 pg ml-1 (Fig. 37 complementaria). Por el contrario, el p-LFA fluorométrico (Fig. 5f y Fig. 38 complementaria) permitió la detección hasta 813 fg ml-1 (Fig. 5g en negro, ajuste logístico de cinco parámetros), medido con el escáner de sobremesa. En particular, con el escáner portátil, el IL-6 p-LFA exhibió un LOD similar, 916 fg ml−1 (Fig. 5g en rojo, ajuste logístico de cinco parámetros). El rendimiento casi idéntico de los escáneres de sobremesa y portátiles se confirmó aún más al comparar las curvas de dosis-respuesta de la proteína N (datos extendidos, figura 1 y figuras complementarias 39 y 40). Tenga en cuenta que el LOD de los LFA de tira completa es más alto en comparación con el formato de media tira mencionado anteriormente debido al tiempo más corto (15 min frente a 20 min) y al volumen de analito más pequeño (70 µl frente a 100 µl) disponible para la unión de los analitos. a las nanomarcas conjugadas con anticuerpos de captura en el formato de tira completa.

Finalmente, para demostrar el potencial de traducción clínica y la posible aplicación POC de p-LFA con el escáner portátil, analizamos 28 muestras de suero y 14 muestras de hisopos NP de individuos con PCR positivo para COVID-19 para la detección de IL-6 (datos extendidos Figs. 2 y 3) y proteína N (Figs. 41 y 42 complementarias), respectivamente. Estas muestras se analizaron con p-LFA de 15 min y se midieron con escáneres portátiles y de sobremesa. Los resultados cuantitativos de los escáneres de sobremesa y portátiles exhibieron una excelente correlación con un valor r de Pearson de 0,97 para IL-6 (Fig. 5h) y 0,94 para las concentraciones de proteína N (Fig. 5j y Tabla complementaria 8). Igualmente importante, las concentraciones de IL-6 determinadas por p-LFA de 15 min y medidas por el escáner portátil también mostraron una excelente correlación con las determinadas por p-FLISA de laboratorio de 4 h de duración (valor r de Pearson de 0,91) (Fig. 5i y Tabla Suplementaria 9).

Esta observación, junto con los parámetros bioanalíticos casi idénticos de la curva estándar de p-LFA generada utilizando los escáneres portátiles y de sobremesa para IL-6 y proteína N, sugiere que la sensibilidad y la capacidad de detección cuantitativa de p-LFA no se ven comprometidas por el uso de un escáner de fluorescencia portátil y económico. Los resultados con este escáner portátil fueron comparables a los obtenidos con las pruebas de laboratorio de 4 h de duración realizadas con el costoso escáner de fluorescencia de sobremesa no portátil. Estos resultados destacan el flujo de trabajo simple de p-LFA y su potencial para el biodiagnóstico en entornos POC.

En resumen, hemos demostrado que los flúor plasmónicos pueden servir como elemento informador bimodal (colorimétrico + fluorescente) para superar las limitaciones de larga data de los LFA. Específicamente, p-LFA supera la sensibilidad limitada, la baja precisión, el rango dinámico pequeño y la capacidad de cuantificación limitada de los LFA en comparación con las pruebas de laboratorio. Los flúores plasmónicos produjeron una señal de fluorescencia perceptible a densidades 10 000 veces más bajas que las necesarias en las AuNP colorimétricas convencionales. Los p-LFA para varios analitos (IL-6, anticuerpos contra el SARS-CoV-2 S1 y antígenos contra el SARS-CoV-2) mostraron una mejora de ~1000 veces en los parámetros bioanalíticos (LOD, LOQ y rango dinámico) con respecto a los LFA convencionales. Los p-LFA ofrecieron una detección cuantitativa sin estándar con una sensibilidad 10 veces mayor que la del ELISA estándar de oro, con un tiempo de respuesta de la muestra mucho más bajo (20 min frente a 4-6 h) y una capacidad similar para resolver la concentración molecular como pruebas de laboratorio. Los p-LFA para la detección de anticuerpos y antígenos de COVID-19 presentes en plasma y muestras de frotis nasofaríngeo lograron una sensibilidad >95 % y una especificidad del 100 %, lo que demuestra su aplicabilidad clínica. El escáner de fluorescencia económico y portátil que desarrollamos y optimizamos para leer p-LFA fue tan eficaz como el escáner de sobremesa que utilizamos. Cuando se aplicaron a muestras humanas de personas positivas para COVID-19, las concentraciones de IL-6 y proteína N medidas durante 15 min p-LFA utilizando los escáneres de sobremesa y portátiles exhibieron una excelente correlación entre sí y también con las concentraciones determinadas por laboratorio. 4 h p-FLISA. Creemos que los p-LFA son muy atractivos para realizar biodiagnósticos POC que requieren una detección precisa y cuantitativa de bioanalitos. La tecnología que se informa aquí se puede adaptar fácilmente para la detección de otros patógenos infecciosos y biomarcadores de enfermedades y podría complementar o incluso reemplazar las pruebas de laboratorio para el diagnóstico de infecciones patógenas y otras afecciones agudas.

Un flúor plasmónico consta de un núcleo plasmónicamente activo, un AuNR sintetizado mediante un método mediado por semillas64, una capa espaciadora de polímero, fluoróforos y un elemento de biorreconocimiento universal (biotina). Los flúor plasmónicos se sintetizaron siguiendo un procedimiento similar al descrito en nuestro estudio anterior27. El procedimiento paso a paso detallado se analiza en Información complementaria.

Los AuNP estabilizados con citrato se sintetizaron utilizando el método de síntesis mediado por semillas y utilizando citrato como agente reductor. Las semillas de Au (~ 15 nm) se sintetizaron como se describió anteriormente en la ref. 65. Brevemente, se llevaron a ebullición 20 ml de HAuCl4 0,25 mM (Sigma Aldrich, 520918) con agitación vigorosa a 800 rpm. Inmediatamente después de que la solución comenzó a hervir, se añadieron 0,2 ml de solución acuosa de citrato de sodio al 3 % (p/v) (Sigma Aldrich, 1613859) y se mantuvo en ebullición hasta que el color de la solución cambió a rojo vino, lo que indica la formación de semillas de Au. A continuación, se sintetizaron AuNP de ~ 100 nm utilizando hidroquinona (Sigma Aldrich, H9003) como agente reductor para la reducción de oro iónico.

Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión se obtuvieron utilizando un instrumento de emisión de campo JEOL JEM-2100F. Los espectros de extinción de las nanoestructuras plasmónicas se obtuvieron utilizando un espectrofotómetro Shimadzu UV-1800. Los mapeos de fluorescencia se registraron utilizando el sistema de imágenes LI-COR Odyssey CLx. Se utilizaron una cámara digital (Sony cybershot DSC HX300) y el software de imágenes ImageJ 1.53e para caracterizar las intensidades medias de gris. Se utilizó el lector de placas SpectraMax iD3 (Molecular Devices) para medir la densidad óptica en ELISA.

Para funcionalizar nanomarcas con estreptavidina (Sigma Aldrich, SA101), se añadió 1 µl de 10 mg ml−1 de estreptavidina (o BSA-biotina o anticuerpo de detección) a 1 ml OD1 de nanomarcas y se incubó durante 1 h en un agitador a temperatura ambiente. . Para estabilizar las partículas, se añadió a la solución 1 µl de 10 mg ml−1 de BSA (Sigma Aldrich, A7030) y se incubó durante 20 min. La proteína no unida se eliminó lavando la solución 4 veces con agua nanopura de pH 10 (1 µl de NaOH en 10 ml de agua). Finalmente, las nanomarcas se redispersaron en BSA al 1% en una solución de PBS 1x para usar en los LFA. Para funcionalizar nanomarcas con anticuerpos (anticuerpo de detección de proteína IL-6 y N e IgG antihumana), se utilizó un proceso similar.

Se utilizaron membranas de prueba de nitrocelulosa y almohadillas absorbentes con material de respaldo adhesivo (GE Healthcare, FF120HP) para fabricar las tiras LFA. La membrana de prueba y la almohadilla absorbente se cortaron en tiras de 4 mm de ancho usando una recortadora de papel. Para preparar la tira LFA, la solución del elemento de biorreconocimiento (por ejemplo, el anticuerpo de captura) se pipeteó sobre la membrana de prueba y se secó a temperatura ambiente durante 30 min. Posteriormente, la membrana de prueba se bloqueó con BSA al 3% en una solución de PBS 1X. A continuación, las tiras se lavaron con PBST (1x PBS y Tween20 al 0,5 % (Sigma Aldrich, P9416)), seguido de secado a temperatura ambiente en un desecador de vacío durante 1 hora. Después del secado, se ensamblaron almohadillas absorbentes (GE Healthcare, CF5) sobre el respaldo adhesivo de poliestireno junto a la membrana de prueba de nitrocelulosa. Para asegurar una transferencia eficiente de la solución de la membrana de prueba a la almohadilla absorbente, aseguramos una superposición de 1 a 2 mm entre ambas tiras. Los experimentos se realizaron sumergiendo LFA en placas de 96 pocillos llenas con 100 µl de soluciones de muestra/estándar durante 20 min. Las señales visuales de los LFA se obtuvieron mediante una cámara digital. Las imágenes se convirtieron a una imagen en escala de grises de 8 bits usando ImageJ. Los valores medios de gris del punto de prueba se calcularon promediando las intensidades de escala de grises del punto de prueba obtenidas de ImageJ. Las señales de fluorescencia se obtuvieron promediando las intensidades de fluorescencia de puntos de prueba obtenidas con el escáner de fluorescencia LI-COR Odyssey CLx utilizando los siguientes parámetros de escaneo: potencia del láser, ~L2; resolución, 21 µm; canal, 800 nm; altura, 0 mm.

Para determinar la concentración óptima de BSA biotinilada en el punto de prueba, se prepararon por duplicado diferentes tiras de LFA con concentraciones variables de BSA biotinilada (100 µg ml−1 a 5 mg ml−1). Luego, los LFA se sometieron a la misma concentración de estreptavidina (1000 ng ml-1 para AuNP-LFA y 1 ng ml-1 para p-LFA) y nanomarcas biotiniladas. Para determinar la concentración óptima de las nanomarcas, se prepararon tiras de LFA con la misma concentración de BSA biotinilada (5 mg ml−1) por duplicado. Estas tiras de LFA se sometieron luego a la misma concentración de estreptavidina (1000 ng ml-1 para AuNP y 1 ng ml-1 para flúor plasmónico) pero diferentes números de nanomarcas funcionalizadas con biotina (4,45 × 106 a 3,56 × 1010 para AuNP y 1,2 × 104 a 6 × 106 para flúor plasmónico). El número óptimo de nanomarcadores para AuNPs-LFA y p-LFA colorimétricos y p-LFA fluorométricos se determinó restando la señal de fondo de la señal del punto de prueba.

Los puntos de prueba se formaron pipeteando 0,5 µl de 5 mg ml−1 de BSA biotinilado sobre la membrana de nitrocelulosa. Las tiras de LFA se ensamblaron como se describe anteriormente. Para el LFA de biotina-estreptavidina basado en AuNP y basado en flúor plasmónico, se mezclaron 1 µl de AuNP biotinilados y 1 µl de flúores plasmónicos biotinilados, respectivamente, con 99 µl de diferentes concentraciones de soluciones estándar de estreptavidina (0,1 pg ml−1 a 1000 µg ml −1) en placas de 96 pocillos para permitir la unión de la estreptavidina con los nanomarcadores biotinilados. Luego, las tiras de LFA por duplicado se expusieron a las soluciones de muestra y estándar durante 20 min.

En el estudio se utilizó el kit ELISA DuoSet de IL-6 humana (R&D Systems, DY206). Para el LFA de IL-6 basado en AuNP, los AuNP se conjugaron con el anticuerpo de detección de IL-6 para el punto de prueba y con IgG anti-oveja (R&D Systems, BAF016) para el punto de control. Para p-LFA, los flúores plasmónicos se conjugaron con el anticuerpo de detección de IL-6 para el punto de prueba, y las AuNP se conjugaron con IgG anti-oveja para el punto de control, respectivamente. Para preparar tiras de LFA para el inmunoensayo de IL-6, se pipetearon 0,5 µl de 2 mg ml−1 de anticuerpo de captura de IL-6 y 0,5 µl de 2 mg ml−1 de IgG de oveja (R&D Systems, 5-001-A) sobre la membrana de nitrocelulosa. en diferentes puntos para crear puntos de prueba y control, respectivamente. Posteriormente, se siguieron pasos similares a los mencionados anteriormente para la preparación y montaje de LFA. Para el LFA de IL-6 basado en AuNP, se mezclaron 1 µl de AuNP conjugado con anticuerpo de detección de IL-6 y 1 µl de AuNP conjugado con IgG anti-oveja para el punto de prueba y control, respectivamente, con 98 µl de diferentes concentraciones de IL-6 humana. soluciones estándar (64 fg ml−1 a 5 ng ml−1) en placas de 96 pocillos para permitir la unión del analito con las nanomarcas conjugadas con anticuerpos de detección. Luego, las tiras de LFA por duplicado se expusieron a las soluciones de muestra y estándar durante 20 min. Para IL-6 p-LFA, se mezclaron 1 µl de flúor plasmónico conjugado con anticuerpo de detección de IL-6 y 1 µl de AuNP conjugados con IgG anti-oveja con 98 µl de soluciones estándar de IL-6 humana (1 fg ml−1 a 1 ng ml −1) en placas de 96 pocillos. Las señales visuales y las señales de fluorescencia se obtuvieron de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente.

El ELISA de IL-6 humana se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito en el manual del kit DuoSet ELISA y se analiza en detalle en Información complementaria. p-FLISA se realizó adoptando un enfoque similar, excepto que la estreptavidina marcada con HRP se reemplazó por flúor plasmónico funcionalizado con estreptavidina. En lugar de estreptavidina-HRP, se incubaron 100 µl de estreptavidina-fluores plasmónicos (OD 1) durante 30 minutos y luego se lavó la placa 3 veces con PBST. Tanto ELISA como p-FLISA se realizaron por duplicado. La señal de fluorescencia se obtuvo promediando las intensidades de fluorescencia de los pocillos de microtitulación obtenidos con LI-COR Odyssey CLx con los siguientes parámetros de exploración: potencia del láser, ~L2; resolución, 169 µm; canal, 800 nm; altura, 4 mm.

Se generaron cuatro curvas estándar de p-LFA IL-6 (1 fg ml−1 a 1 ng ml−1) durante un lapso de 6 meses, y las muestras con concentraciones variables de IL-6 (0,5 pg ml−1 a 62,5 pg ml− 1) se probaron por duplicado sin estándar. Sus concentraciones experimentales se determinaron utilizando cada curva estándar y se calcularon las desviaciones de las concentraciones reales.

Pipeteamos 0,5 µl de 2 mg ml−1 de proteína recombinante SARS-CoV-2 S1 (R&D Systems, 10522-CV) y 0,5 µl de 2 mg ml−1 de IgG de oveja en la membrana de nitrocelulosa como punto de prueba y control, respectivamente. Posteriormente, seguimos los mismos pasos descritos anteriormente para preparar las tiras de LFA. Para detectar anticuerpos contra el SARS-CoV-2 S1, se conjugaron AuNP-LFA y p-LFA, AuNP y flúor plasmónico con IgG antihumana biotinilada (Rockland, 609-4617) para puntos de prueba, respectivamente. En ambos casos, las AuNP se conjugaron con IgG anti-oveja para el punto de control. Para el LFA de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 S1 basado en AuNP, se mezclaron 1 µl de AuNP conjugados con IgG antihumana y 1 µl de AuNP conjugados con IgG antioveja con diferentes concentraciones de soluciones estándar (16 pg ml−1 a 25 µg ml −1) en placas de 96 pocillos, antes de la exposición a la tira LFA durante 20 min. Para el anticuerpo LFA del SARS-CoV-2 S1 basado en flúor plasmónico, se mezclaron 1 µl de flúores plasmónicos conjugados con IgG antihumana y 1 µl de AuNP conjugados con IgG antioveja con diferentes concentraciones de soluciones estándar (16 pg ml−1 a 1 µg ml−1) en placas de 96 pocillos, antes de la exposición a la tira LFA durante 20 min. Las muestras de plasma se diluyeron 500 veces en diluyente reactivo (1x PBS que contenía BSA al 3 %, filtrado por 0,2 µm) antes de su uso. Todos los experimentos se realizaron por duplicado. Las señales visuales y las señales de fluorescencia se obtuvieron utilizando el mismo procedimiento mencionado anteriormente.

El ELISA de anticuerpos SARS-CoV-2 S1 se llevó a cabo de acuerdo con el siguiente procedimiento. Los pocillos de microtitulación por duplicado se recubrieron con 100 µl de 5 µg ml−1 (en 1x PBS) de proteína SARS-CoV-2 S1 recombinante mediante incubación durante la noche a temperatura ambiente. Para el bloqueo, se añadieron 300 µl de diluyente de reactivo a los pocillos durante un mínimo de 1 hora. A continuación, se incubaron 100 µl de muestras estándar diluidas en serie durante 2 h, seguido de incubación de 100 µl de 100 ng ml−1 de IgG antihumana biotinilada durante 2 h. A continuación, se incubaron 100 µl de 500 ng ml−1 de HRP marcada con estreptavidina (Thermo Fisher Scientific, N100) durante 20 min, seguido de la adición de 100 µl de solución de sustrato durante 20 min. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 µl de H2SO4 2 N (R&D Systems, DY994) e inmediatamente se midió la densidad óptica a 450 nm utilizando un lector de microplacas. p-FLISA se llevó a cabo adoptando un procedimiento similar, excepto que la estreptavidina marcada con HRP se reemplazó por flúor plasmónico funcionalizado con estreptavidina. En lugar de HRP, se incubaron 100 µl de flúor plasmónico (OD 1) durante 30 min y luego se lavó la placa 3 veces con PBST. La señal de fluorescencia se obtuvo promediando las intensidades de fluorescencia de los pocillos de microtitulación obtenidos con LI-COR Odyssey CLx.

Pipeteamos 0,5 µl de 2 mg ml−1 de anticuerpos de captura de proteína N (SinoBiologicals, 40143-MM08) y 0,5 µl de 2 mg ml−1 de IgG de oveja en la membrana de nitrocelulosa como puntos de prueba y control, respectivamente. Para la proteína N p-LFA, se conjugaron flúores plasmónicos con un anticuerpo de detección de proteína N biotinilado (SinoBiologicals, 40143-R004) para los puntos de prueba. Se usaron AuNP conjugados con IgG anti-oveja para el punto de control. Posteriormente, se siguieron pasos similares a los mencionados anteriormente para preparar y ensamblar las tiras de LFA. Para LFA de proteína N basada en flúor plasmónico, se incubaron 1 µl de harinas plasmónicas conjugadas con anticuerpos de detección y 1 µl de AuNP conjugados con IgG anti-oveja con diferentes concentraciones de solución estándar (12 pg ml−1 y 1 µg ml−1; SinoBiologicals , 40588-V08B) enriquecidos en medios de transporte universal (UTM) en placas de 96 pocillos antes de la exposición a tiras LFA durante 20 min. Los p-LFA se utilizaron para la detección de proteína N presente en muestras de hisopos nasofaríngeos de pacientes. Las muestras de hisopado nasofaríngeo estaban en UTM y se utilizaron sin ninguna dilución ni procesamiento. Todos los experimentos se realizaron por duplicado. Las señales visuales y las señales de fluorescencia se obtuvieron utilizando el mismo proceso descrito anteriormente.

El ELISA de proteína N se llevó a cabo recubriendo primero los pocillos de microtitulación por duplicado con 100 µl de 100 ng ml-1 de anticuerpos de captura de proteína N (en PBS 1x) mediante incubación durante la noche a temperatura ambiente. Para el bloqueo, se añadieron 300 µl de diluyente de reactivo a los pocillos durante un mínimo de 1 h. A continuación, se incubaron 100 µl de muestras estándar diluidas en serie durante 2 h, seguido de incubación de 100 µl de 200 ng ml−1 de anticuerpo de detección de proteína N biotinilado durante 2 h. A continuación, se incubaron 100 µl de 500 ng ml−1 de HRP marcada con estreptavidina (Thermo Fisher Scientific, N100) durante 20 min, seguido de la adición de 100 µl de solución de sustrato durante 20 min. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 µl de H2SO4 2 N (R&D Systems, DY994), e inmediatamente se midió la densidad óptica a 450 nm utilizando un lector de microplacas. p-FLISA se llevó a cabo adoptando un procedimiento similar, excepto que la estreptavidina marcada con HRP se reemplazó por flúor plasmónico funcionalizado con estreptavidina. En lugar de HRP, se incubaron 100 µl de flúor plasmónico (OD 1) durante 30 min y luego se lavó la placa 3 veces con PBST. La señal de fluorescencia se obtuvo promediando las intensidades de fluorescencia de los pocillos de microtitulación obtenidos con LI-COR Odyssey CLx.

Se utilizó el kit BD Veritor, Veritor System, para la detección rápida de SARS-CoV-2, para analizar la presencia de proteína N en las muestras de los pacientes. BD Veritor System se utilizó junto con BD Veritor Plus Analyzer. Los hisopos NP se eluyeron en medio de transporte UTM y Aimes (ESwab). La validación interna y la precisión del ensayo se realizaron y se consideraron aceptables para realizar pruebas en muestras clínicas por parte del Laboratorio de microbiología clínica judía de Barnes.

Las muestras de suero o plasma recolectadas antes del brote de COVID-19 se recolectaron bajo el estudio aprobado por la Oficina de Protección de Investigación Humana de la Universidad de Washington en St. Louis bajo HRPO 201102546. Las muestras clínicas utilizadas en el estudio se obtuvieron del depósito de saliva, suero , plasma y muestras de hisopos NP de personas confirmadas o sospechosas con la enfermedad COVID-19, ubicadas en la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington en St Louis, y del Laboratorio de Microbiología Clínica Judía de Barnes; la adquisición de muestras fue apoyada por: la Fundación del Hospital Barnes-Jewish; la subvención del Centro de Cáncer Siteman P30 CA091842 del Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud (NIH); y la subvención UL1TR002345 del Instituto de Ciencias Clínicas y Traslacionales de la Universidad de Washington del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales (NCATS) de los NIH. Este repositorio fue desarrollado y es mantenido por Jane O'Halloran, MD, PhD; Charles Goss, PhD; y Phillip Mudd, MD, PhD. Se obtuvieron muestras de hisopos NP de control de voluntarios sanos asintomáticos con consentimiento previo por escrito. Para la evaluación de la reactividad cruzada con coronavirus estacionales, se obtuvieron muestras de adultos en el Barnes-Jewish Hospital que dieron positivo con cualquiera de los cuatro coronavirus estacionales o enfermedades respiratorias a través de pruebas de muestras NP clínicamente justificadas. La Oficina de Protección de Investigación Humana de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington aprobó el estudio. Todos los datos clínicos preexistían en el momento de la recogida de datos. Se obtuvo una renuncia previa al consentimiento para la información clínica y los datos sobre los resultados de la PCR de COVID-19.

Los componentes de p-LFA de tira completa incluyen: membrana NC, FF80HP sobre respaldo de poliestireno (número de catálogo 10547020, de Whatman, Cytiva); almohadilla de muestra, Fusion 5 (número de catálogo 8151-9915, de Whatman, Cytiva); almohadilla conjugada, Whatman Standard 14 (8133-2250, Cytiva); y almohadilla de absorción, CF5 (número de catálogo 8115-2250, Cytiva). Las almohadillas de muestra y conjugado se sometieron al siguiente proceso de pretratamiento: las almohadillas de muestra se empaparon en BSA al 5 %, Tween 20 al 0,5 % y PBS 1x y luego se secaron en un horno a 37 °C durante 2 h. Las almohadillas de conjugado se empaparon en BSA al 5 %, sacarosa al 10 %, Tween 20 al 0,5 % y PBS 1x y luego se secaron en un horno a 37 °C durante 2 h. Después del pretratamiento, las almohadillas de muestra y conjugado se cortaron en tiras de 15 mm × 25 mm y 13 mm × 25 mm de dimensiones, respectivamente. Las almohadillas de absorción se usaron tal como se recibieron y se cortaron en dimensiones de 18 mm × 25 mm.

Para preparar nanoetiquetas para la línea de prueba, se agregaron 1–3 µl de proteína N biotinilada de SARS-CoV-2 o anticuerpo de detección de IL-6 humana de 1 mg ml−1 de concentración a 1 ml de flúor plasmónico de extinción 2 funcionalizado con estreptavidina. Después de 30 min de incubación, se añadieron 100 µl de BSA al 10 % en PBS 1x a esta solución de flúor plasmónico conjugado con anticuerpo. Después de otra incubación de 30 min, la solución de nanomarca conjugada se centrifugó 3 veces para eliminar los anticuerpos de detección no unidos y la solución posterior se dispersó nuevamente a borato de sodio 2 mM, pH 8,5 con sacarosa al 10%. Para la preparación de nanomarcas para la línea de control, se añadieron 1–5 µl de IgG anti-cabra biotinilada de 2 mg ml−1 de concentración a 1 ml de flúor plasmónico de extinción 2 de estreptavidina. Después de 30 min de incubación, 100 µl de BSA al 10 % en 1 Se añadió × PBS a esta solución conjugada de anticuerpo-flúor plasmónico. Después de otra incubación de 30 min, la solución de nanomarcador conjugada se centrifugó 3 veces y se dispersó nuevamente a borato de sodio 2 mM de pH 8,5 que consistía en sacarosa al 10%.

A continuación, las nanomarcas para las líneas de prueba y de control se mezclaron en una proporción de 1:1. A continuación, la solución resultante se pulverizó sobre la almohadilla de conjugado pretratada. La solución de nanoetiquetas se roció con chorro de aire con una velocidad de dispensación de 5 µl cm−1 utilizando un dispensador de reactivos (XYZ Platform Dispenser HM3030, Kinbio). Después de rociarlas, las almohadillas de conjugado se secaron en un horno a 37 °C durante 2 h. A continuación, se preparó la membrana de prueba imprimiendo los anticuerpos de captura específicos de las líneas de prueba y de control. Para la línea de prueba, SARS-CoV-2 Ag y anticuerpo de captura de IL-6 humana de 1 mg ml−1 de concentración y para la línea de control de cabra IgG de 2 mg ml−1 de concentración se imprimieron simultáneamente en una membrana de prueba de nitrocelulosa FF80HP a una velocidad de dosificación de 0,5 µl cm−1 y velocidad de 50 mm s−1 mediante un dispensador de reactivos (XYZ Platform Dispenser HM3030, Kinbio). Posteriormente, las membranas se secaron en estufa a 37 °C durante 2 h.

Finalmente, la almohadilla de muestra pretratada, la almohadilla de conjugado después de la pulverización de nanomarcas y la almohadilla de membrana después de la impresión de anticuerpos de captura se ensamblaron con una superposición de 2 mm entre cada almohadilla y se cortaron en tiras con un ancho de 3 mm utilizando un cortador de tiras ( Cortador de tiras programable ZQ2002, Kinbio). Para ver la ilustración esquemática del diseño de p-LFA, consulte la Fig. 45 complementaria.

Se utilizó un láser de diodo de 80 mW y 785 nm (Zlaser, Z80M18S3-F-785-pe) como fuente de excitación. El rayo láser se atenuó con un filtro de densidad neutra al 1% y se le dio forma en una línea de 4 mm de ancho usando la combinación del control de enfoque del láser y una lente plano-convexa cilíndrica de 30 mm de longitud focal. La fluorescencia se recogió con una lente plano-convexa de 30 mm de longitud focal (12,5 mm de diámetro) y se pasó a través de un filtro de emisión de 832/37 nm (Edmund Optics, 84-107). Se utilizó una lente doble acromática de distancia focal de 45 mm (Edmund Optics, 49-355) para formar una imagen ampliada × 1,5 de la tira de flujo lateral en el sensor de la cámara (ZWO ASI462MC). La fluorescencia se midió en un ángulo de 45° con respecto a la excitación. Las mediciones de casetes de flujo lateral se llevaron a cabo traduciendo la muestra (usando el actuador de recorrido Actuonix L16-R de 50 mm) a través del sistema óptico a 1 mm s−1 mientras se transmitía el video de la cámara. Se realizó un video con 100 ms de exposición (10 imágenes por segundo). El valor de píxel promedio de cada diez imágenes se utilizó para el análisis y correspondió a un punto en el trazo producido por este instrumento. Se utilizó una computadora de placa única Raspberry Pi 4 para controlar todos los componentes de hardware del instrumento.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos principales que respaldan los resultados de este estudio están disponibles en el documento y en la Información complementaria. Todos los datos generados en este estudio están disponibles en figshare a través del identificador https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21556365.

El código para el cálculo de parámetros RMC µ y RMC y las instrucciones sobre cómo usar el código para Langmuir y el ajuste logístico de cinco parámetros están disponibles en https://github.com/seanwangsalad/PythonRMC. El código para procesar los datos del escáner portátil y las instrucciones sobre cómo usar el código están disponibles en https://github.com/seanwangsalad/AreaUnderCurveForLFAReader.

Soh, JH, Chan, H.-M. & Ying, JY Estrategias para desarrollar ensayos de flujo lateral basados ​​en nanopartículas sensibles y específicos como dispositivo de diagnóstico en el punto de atención. Nano Hoy 30, 100831 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Nguyen, V.-T., Song, S., Park, S. y Joo, C. Avances recientes en métodos de detección de alta sensibilidad para ensayos de flujo lateral en papel. Biosens. Bioelectrón. 152, 112015 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Li, Z. et al. Desarrollo y aplicación clínica de una prueba rápida de anticuerpos combinados IgM-IgG para el diagnóstico de la infección por SARS-CoV-2. J.Med. Virol. 92, 1518–1524 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Charlton, CL et al. Evaluación de seis ensayos comerciales de anticuerpos de volumen medio a alto y seis ensayos de flujo lateral en el punto de atención para la detección de anticuerpos contra el SARS-CoV-2. J. Clin. Microbiol. 58, e01361-20 (2020).

Artículo Google Académico

Hegestad, JT et al. Perfil serológico cuantitativo multiplexado de COVID-19 a partir de sangre mediante una prueba en el punto de atención. ciencia Adv. 7, eabg4901 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Mertens, P. et al. Desarrollo y utilidad potencial del ensayo de diagnóstico COVID-19 Ag Respi-Strip en un contexto pandémico. Frente. Medicina. 7, 225 (2020).

Artículo Google Académico

Porte, L. et al. Evaluación de una nueva prueba de detección rápida basada en antígenos para el diagnóstico de SARS-CoV-2 en muestras respiratorias. En t. J. infectar. Dis. 99, 328–333 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Pickering, S. et al. La evaluación comparativa de múltiples tecnologías serológicas de COVID-19 respalda la evaluación continua de los ensayos de flujo lateral en el punto de atención en entornos de atención médica hospitalaria y comunitaria. Patog de PLoS. 16, e1008817 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Kontou, PI, Braliou, GG, Dimou, NL, Nikolopoulos, G. y Bagos, PG Pruebas de anticuerpos para detectar la infección por SARS-CoV-2: un metanálisis. Diagnóstico 10, 319 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Hu, J. et al. Plataforma de ensayo multimodal basada en nanoesferas colorimétricas, fluorescentes y magnéticas para la detección de Salmonella. Anal. química 91, 1178–1184 (2018).

Artículo Google Académico

Posthuma-Trumpie, GA, Korf, J. & van Amerongen, A. Ensayo de flujo lateral (inmuno): sus fortalezas, debilidades, oportunidades y amenazas. Una encuesta de literatura. Anal. Bioanal. química 393, 569–582 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Hu, J. et al. Avances en diagnósticos en el punto de atención basados ​​en papel. Biosens. Bioelectrón. 54, 585–597 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Huang, L. et al. Etiquetas fluorescentes plasmónicas jerárquicas para inmunoensayo de flujo lateral altamente sensible con cambio flexible de doble modalidad. Aplicación ACS. Mate. Interfaces 12, 58149–58160 (2020).

Artículo CAS Google Académico

García-Basteiro, AL et al. Monitoreo de la epidemia de COVID-19 en el contexto de transmisión local generalizada. Lanceta Respir. Medicina. 8, 440–442 (2020).

Artículo Google Académico

Actualización epidemiológica semanal de COVID-19, 25 de mayo de 2021 (Organización Mundial de la Salud, 2021).

Pang, J. et al. Posibles diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para el nuevo coronavirus de 2019 (2019-nCoV): una revisión sistemática. J. Clin. Medicina. 9, 623 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Yu, F. et al. Detección cuantitativa y análisis de carga viral de SARS-CoV-2 en pacientes infectados. clin. Infectar. Dis. 71, 793–798 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Che, X.-y et al. Inmunoensayo enzimático de captura basado en anticuerpos monoclonales sensibles y específicos para la detección del antígeno de la nucleocápside en sueros de pacientes con síndrome respiratorio agudo severo. J. Clin. Microbiol. 42, 2629–2635 (2004).

Artículo CAS Google Académico

Di, B. et al. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de captura de antígeno basado en anticuerpos monoclonales revela una alta sensibilidad de la proteína de la nucleocápside en sueros de fase aguda de pacientes con síndrome respiratorio agudo severo. clin. Vacuna Immunol. 12, 135–140 (2005).

Artículo CAS Google Académico

Largo, Q.-X. et al. Respuestas de anticuerpos al SARS-CoV-2 en pacientes con COVID-19. Nat. Medicina. 26, 845–848 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Peterhoff, D. et al. Un ensayo serológico altamente específico y sensible detecta niveles de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 en pacientes con COVID-19 que se correlacionan con la neutralización. Infección 49, 75–82 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Tromberg, BJ y col. Ampliación rápida de las pruebas de diagnóstico de COVID-19 en los Estados Unidos: la iniciativa NIH RADx. N. ingl. J.Med. 383, 1071–1077 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Valera, E. et al. Diagnóstico en el punto de atención de COVID-19: presente y futuro. ACS Nano 15, 7899–7906 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Hu, J. et al. Detección sensible y cuantitativa de proteína de reacción C basada en nanoesferas inmunofluorescentes acopladas con tira de prueba de flujo lateral. Anal. química 88, 6577–6584 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Udugama, B. et al. Diagnóstico de COVID-19: la enfermedad y herramientas para su detección. ACS Nano 14, 3822–3835 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Jain, PK, Lee, KS, El-Sayed, IH & El-Sayed, MA Propiedades calculadas de absorción y dispersión de nanopartículas de oro de diferente tamaño, forma y composición: aplicaciones en imágenes biológicas y biomedicina. J. física. química B 110, 7238–7248 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Luan, J. et al. Etiquetas fluorescentes ultrabrillantes a nanoescala para la detección femtomolar de analitos con bioensayos estándar. Nat. biomedicina Ing. 4, 518–530 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Tam, F., Goodrich, GP, Johnson, BR y Halas, NJ Mejora plasmónica de la fluorescencia molecular. Nano Lett. 7, 496–501 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Kinkhabwala, A. et al. Grandes mejoras de fluorescencia de una sola molécula producidas por una nanoantena corbatín. Nat. Fotón. 3, 654–657 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Zhang, B., Kumar, RB, Dai, H. & Feldman, BJ Un chip plasmónico para el descubrimiento de biomarcadores y el diagnóstico de diabetes tipo 1. Nat. Medicina. 20, 948–953 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Bardhan, R., Grady, NK, Cole, JR, Joshi, A. y Halas, NJ Mejora de la fluorescencia mediante nanoestructuras de oro: nanocapas y nanobarras. ACS Nano 3, 744–752 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Rycenga, M. et al. Control de la síntesis y ensamblaje de nanoestructuras de plata para aplicaciones plasmónicas. química Rev. 111, 3669–3712 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Moghadam, BY, Connelly, KT y Posner, JD Mejora de dos órdenes de magnitud en el límite de detección de los ensayos de flujo lateral mediante isotacoforesis. Anal. química 87, 1009–1017 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Mosley, GL, Nguyen, P., Wu, BM & Kamei, DT Desarrollo de metodologías radioactivas cuantitativas en papel para determinar parámetros importantes de inmunoensayo de flujo lateral. Ficha de laboratorio 16, 2871–2881 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Zhan, L. et al. El papel del diseño de nanopartículas en la determinación del rendimiento analítico de los inmunoensayos de flujo lateral. Nano Lett. 17, 7207–7212 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Chen, H., Shao, L., Li, Q. & Wang, J. Nanovarillas de oro y sus propiedades plasmónicas. química Soc. Rev. 42, 2679–2724 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Dreaden, EC, Alkilany, AM, Huang, X., Murphy, CJ y El-Sayed, MA La edad de oro: nanopartículas de oro para la biomedicina. química Soc. Rev. 41, 2740–2779 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Liang, C. et al. Mejora de la fluorescencia dependiente del tamaño de nanovarillas de oro para fluoroinmunoensayos ultrasensibles. Aplicación ACS. Mate. Interfaces 13, 11414–11423 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Weber, PC, Ohlendorf, DH, Wendoloski, J. y Salemme, F. Orígenes estructurales de la unión de biotina de alta afinidad a la estreptavidina. Ciencia 243, 85–88 (1989).

Artículo CAS Google Académico

Schett, G., Elewaut, D., McInnes, IB, Dayer, J.-M. & Neurath, MF Cómo las redes de citoquinas alimentan la inflamación: hacia una taxonomía de enfermedades basada en citoquinas. Nat. Medicina. 19, 822–824 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Coussens, LM & Werb, Z. Inflamación y cáncer. Naturaleza 420, 860–867 (2002).

Artículo CAS Google Académico

McInnes, IB & Schett, G. Cytokines en la patogénesis de la artritis reumatoide. Nat. Rev. Inmunol. 7, 429–442 (2007).

Artículo CAS Google Académico

de Souza Sene, I. et al. Un ensayo de flujo lateral en el punto de atención para la detección rápida y colorimétrica de interleucina 6 y perspectivas en el diagnóstico de cabecera. J. Clin. Medicina. Res. 2, 1–16 (2020).

Google Académico

Huang, D. et al. Detección rápida y sensible de interleucina-6 en suero mediante inmunoensayo de flujo lateral con resolución temporal. Anal. Bioquímica 588, 113468 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Swanson, C. & D'Andrea, A. Ensayo de flujo lateral con tinte infrarrojo cercano para detección multiplex. clin. química 59, 641–648 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Tang, J., Wu, L., Lin, J., Zhang, E. & Luo, Y. Desarrollo de una tira de inmunoensayo de flujo lateral de fluorescencia basada en puntos cuánticos para la detección rápida y cuantitativa de la interleucina-6 sérica. J. Clin. Laboratorio. Anal. 35, e23752 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Wilson, BD, Eisenstein, M. & Soh, HT Comparación de ensayos a través de la resolución de la concentración molecular. Nat. biomedicina Ing. 6, 227–231 (2022).

Artículo Google Académico

Huang, C., Wen, T., Shi, F.-J., Zeng, X.-Y. & Jiao, Y.-J. Detección rápida de anticuerpos IgM contra el virus SARS-CoV-2 a través de un ensayo de flujo lateral basado en nanopartículas de oro coloidal. ACS Omega 5, 12550–12556 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Amanat, F. et al. Un ensayo serológico para detectar la seroconversión de SARS-CoV-2 en humanos. Nat. Medicina. 26, 1033–1036 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Fischer, PU et al. Evaluación de pruebas comerciales de flujo lateral rápido, solas o en combinación, para la prueba de anticuerpos contra el SARS-CoV-2. Soy. J. trop. Medicina. Hig. 105, 378–386 (2021).

Subvención, BD et al. Ensayo de flujo lateral de media tira de detección de antígeno de nucleocápside del coronavirus SARS-CoV-2 para el desarrollo de pruebas en el punto de atención utilizando reactivos disponibles comercialmente. Anal. química 92, 11305–11309 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Mina, MJ, Parker, R. & Larremore, DB Repensando la sensibilidad de la prueba COVID-19: una estrategia para la contención. N. ingl. J.Med. 383, e120 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Él, X. et al. Dinámica temporal en la eliminación viral y transmisibilidad de COVID-19. Nat. Medicina. 26, 672–675 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Peeling, RW, Olliaro, PL, Boeras, DI & Fongwen, N. Ampliación de las pruebas rápidas de antígeno de COVID-19: promesas y desafíos. Lanceta Infectada. Dis. 21, E290–E295 (2021).

Artículo CAS Google Académico

La Scola, B. et al. Carga de ARN viral determinada por cultivo celular como herramienta de gestión para el alta de pacientes con SARS-CoV-2 de salas de enfermedades infecciosas. EUR. J. Clin. Microbiol. Infectar. Dis. 39, 1059–1061 (2020).

Artículo Google Académico

McKay, SL et al. Evaluación del rendimiento de las pruebas rápidas de antígenos de SARS-CoV-2 en serie durante un brote en un hogar de ancianos. Ana. Interno. Medicina. 174, 945–951 (2021).

Artículo Google Académico

Wolfel, R. et al. Evaluación virológica de pacientes hospitalizados con COVID-2019. Naturaleza 581, 465–469 (2020).

Artículo Google Académico

Kruger, LJ et al. Precisión y facilidad de uso de siete pruebas de detección de antígenos de SARS-CoV-2 en el punto de atención: una evaluación clínica multicéntrica. EBioMedicine 75, 103774 (2022).

Mattiuzzi, C., Henry, BM & Lippi, G. Dar sentido a las pruebas rápidas de antígenos en el diagnóstico del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2). Diagnóstico 8, 27–31 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Dinnes, J. et al. Pruebas moleculares y de antígeno rápidas en el punto de atención para el diagnóstico de la infección por SARS‐CoV‐2. Sistema de base de datos Cochrane. Rev. 3, CD013705 (2021).

Google Académico

Liotti, FM et al. Rendimiento de un nuevo ensayo de diagnóstico para la detección rápida del antígeno SARS-CoV-2 en muestras de nasofaringe. clin. Microbiol. Infectar. 27, 487–488 (2020).

Artículo Google Académico

Syamchand, S. & Sony, G. Europium habilitó nanopartículas luminiscentes para aplicaciones biomédicas. J. Lumin. 165, 190–215 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Kundu, J., Ghosh, Y., Dennis, AM, Htoon, H. & Hollingsworth, JA Puntos cuánticos de nanocristales gigantes: fósforos estables de conversión descendente que aprovechan un gran cambio de Stokes y una relajación energética eficiente de la capa al núcleo. Nano Lett. 12, 3031–3037 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Gupta, R. et al. Nanobiosensor refrescable basado en encapsulación de organosílice de elementos de biorreconocimiento. Aplicación ACS. Mate. Interfaces 12, 5420–5428 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Frens, G. Nucleación controlada para la regulación del tamaño de partícula en suspensiones monodispersas de oro. Nat. física ciencia 241, 20–22 (1973).

Artículo CAS Google Académico

Descargar referencias

Reconocemos el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias (CBET-2027145, CBET-2029105 y CMMI 1548571) y el Instituto Nacional del Cáncer-Tecnologías Innovadoras de Análisis Molecular (R21CA236652 y R21CA236652-S1). La investigación informada en esta publicación fue apoyada por la subvención UL1TR002345 del Instituto de Ciencias Clínicas y Traslacionales de la Universidad de Washington del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales (NCATS) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). También agradecemos a Nano Research Facility (NRF) y al Instituto de Ciencia e Ingeniería de Materiales (IMSE) de la Universidad de Washington por brindar acceso a las instalaciones de microscopía electrónica. Parte de las ilustraciones esquemáticas representadas en las Figs. 1a, 2a, 3a, 4a y 5b se crearon en BioRender.com. Agradecemos a H. Baldi por su ayuda con las imágenes de BioRender. Agradecemos a MS Diamond, A. Ellebedy, DH Fremont y SPJ Whelan de la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington y a J. Luan de la Escuela de Ingeniería McKelvey de la Universidad de Washington por sus útiles debates. Agradecemos a GJ Weil y PU Fischer, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, por proporcionar amablemente muestras anteriores a la COVID-19. Las muestras utilizadas en este estudio se obtuvieron del biorepositorio COVID-19 de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, que cuenta con el apoyo de la Fundación del Hospital Barnes-Jewish; la subvención P30 CA091842 del Siteman Cancer Center del Instituto Nacional del Cáncer de los NIH; y la subvención UL1TR002345 del Instituto de Ciencias Clínicas y Traslacionales de la Universidad de Washington de NCATS de los NIH. Este repositorio fue desarrollado y es mantenido por J. O'Halloran, C. Goss y P. Mudd. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión de los NIH.

Departamento de Ingeniería Mecánica y Ciencia de los Materiales, Instituto de Ciencia e Ingeniería de los Materiales, Universidad de Washington en St. Louis, St. Louis, MO, EE. UU.

Rohit Gupta, Prashant Gupta, Anushree Seth, Zheyu Wang, Guy M. Genin y Srikanth Singamaneni

Departamento de Biología, Universidad de Washington en St. Louis, St. Louis, MO, EE. UU.

Sean Wang

Auragent Bioscience LLC, St. Louis, MO, EE. UU.

Artem Melnykov y Qisheng Jiang

Departamento de Anestesiología, División de Investigación Clínica y Traslacional, Universidad de Washington en St. Louis, St. Louis, MO, EE. UU.

Jeremiah J. Morrissey y Pratik Sinha

Siteman Cancer Center, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis, MO, EE. UU.

Jeremiah J. Morrissey y Srikanth Singamaneni

Departamento de Medicina Interna, División de Enfermedades Infecciosas, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis, MO, EE. UU.

Ige George y Sumanth Gandra

Departamento de Pediatría, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis, MO, EE. UU.

Gregorio A. Storch

Departamento de Patología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis, MO, EE. UU.

Bijal A. Parij

Centro de Ciencia y Tecnología de NSF para Ingeniería MecanoBiología, Universidad de Washington en St. Louis, St. Louis, MO, EE. UU.

Guy M. Genin

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

SS y RG concibieron el proyecto. RG, SS, IG, SG, GAS, PS, BAP, JJM y GMG diseñaron los experimentos. RG sintetizó las nanoetiquetas y realizó los experimentos. RG y PG configuraron las tiras LFA. SW y RG hicieron los cálculos matemáticos para RMC y escribieron el código requerido para los cálculos de parámetros de RMC. AM desarrolló el escáner de mano/portátil. QJ configuró los LFA de tira completa y las nanoetiquetas requeridas. RG y JJM realizaron inmunoensayos de flujo lateral de anticuerpos contra el SARS-CoV-2. RG y ZW realizaron inmunoensayos de anticuerpos contra el SARS-CoV-2. RG y AS realizaron inmunoensayos de antígeno SARS-CoV-2 y analizaron muestras de hisopos nasales. RG y SW realizaron los experimentos con el escáner de mano y el posterior procesamiento de datos. RG, SS, IG, SG, GAS, BAP, JJM y GMG analizaron los resultados. RG, SS y GMG escribieron el documento. Todos los autores revisaron y comentaron el artículo.

Correspondencia a Srikanth Singamaneni.

JJM y SS son inventores de una patente provisional relacionada con la tecnología de flúor plasmónico, y la tecnología ha sido autorizada por la Oficina de Gestión de Tecnología de la Universidad de Washington en St. Louis a Auragent Bioscience LLC, que está desarrollando productos de flúor plasmónico. JJM y SS son cofundadores y accionistas de Auragent Bioscience LLC. JJM y SS junto con la Universidad de Washington pueden obtener ganancias financieras a través de Auragent Bioscience LLC a través de este acuerdo de licencia. AM, QJ y AS trabajan actualmente con Auragent Bioscience LLC. Estos posibles conflictos de interés han sido divulgados y están siendo administrados por la Universidad de Washington en St. Louis. Los demás autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Biomedical Engineering agradece a David Walt y Daming Wang por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

( a ) Imágenes de fluorescencia dependientes de la dosis de la membrana de nitrocelulosa correspondientes a diferentes concentraciones de soluciones de proteína N adquiridas de LFA de proteína N basada en flúor plasmónico y medidas por ( b ) escáner de sobremesa y ( c ) escáner portátil.

Ilustración esquemática de la tira completa de IL-6 p-LFA empleada para la detección cuantitativa de IL-6 en el suero de individuos positivos para COVID-19 (confirmados por PCR).

Ejemplos representativos de procesamiento de datos realizados en datos adquiridos por escáner portátil de tiras de p-LFA de IL-6 expuestas a la muestra de suero (a, b) de los individuos PCR positivos y (c, d) en blanco para el análisis cuantitativo de IL-6 concentración.

Métodos complementarios, figuras, tablas y referencias.

Springer Nature o su licenciante (p. ej., una sociedad u otro socio) posee los derechos exclusivos de este artículo en virtud de un acuerdo de publicación con los autores u otros titulares de derechos; el autoarchivo del autor de la versión manuscrita aceptada de este artículo se rige únicamente por los términos de dicho acuerdo de publicación y la ley aplicable.

Reimpresiones y permisos

Gupta, R., Gupta, P., Wang, S. et al. Ensayos ultrasensibles de flujo lateral a través de nanopartículas fluorescentes conjugadas con anticuerpos plasmónicamente activos. Nat. biomedicina ing (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-022-01001-1

Descargar cita

Recibido: 14 enero 2022

Aceptado: 20 de diciembre de 2022

Publicado: 02 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-022-01001-1

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt